Novel hybrid structures based on enzymes/1D oxide nanostructures for soil fertility increasing via accelerating bio-degradation rate

Structuri hibride inovatoare bazate pe enzime / oxizi nanostructurati 1D pentru cresterea fertilitatii solului prin accelerarea vitezei de biodegradare

Incheiat in cadrul PN-III-P2-2.1-PED-2016-1395

REZULTATE & LIVRABILE (NEW)

Raport de activitate cu rezultate si livrabile pentru anul 2017

Etapa 1 a proiectului, desfasurata in cursul anului 2017, a avut ca directii principale de plan „Sinteza nanotuburilor de SiO2 si TiNT si identificarea tulpinilor bacteriene halofilice / halotolerante capabile sa produca enzime extracelulare; Prepararea, caracterizarea si activitatea enzimatica a sistemului hibrid (enzima/matrice oxidica)”

Obiectivele proiectului pentru această etapă au fost ȋndeplinite integral iar diseminarea rezultatelor obţinute s-a realizat prin elaborarea a patru articole ştiinţifice de specialite publicate/acceptate/in evaluare ȋn reviste ISI. De asemenea, membrii echipei au participat la conferinţe ştiinţifice de specialitate unde au fost susţinute noua lucrări (4 prezentări orale şi 5 postere). Conferinţele au fost organizate ȋn Italia, Polonia, Spania, Belgia şi România. Rezultatele obţinute corespund cu rezultatele aşteptate după cum este menţionat ȋn Planul de realizare a proiectului. De asemenea, echipa din IBB a realizat o serie de deplasări ȋn teren pentru prelevarea de probe de sol din zonele Movila Miresei, judeţul Buzău şi Şotrile – Baraj Paltinu din judeţul Prahova. Probele de sol au fost necesare pentru implementarea ultimei etape din anul 2017.

Rezultatele & livrabilele obţinute ȋn urma realizării activităţilor prevazute in planul de realizare a proiectului:

Act. 1.1 Sinteza nanotuburilor de SiO2 prin metoda sol gel conform cu rezultatele noastre publicate anterior (ICF)
Au fost obtinute pulberi de SiO2 cu morfologie tubulara (SiO2_NT) in cadrul ICF, utilizand rute de sinteza viabile si reproductibile [C. Anastasescu, M. Zaharescu, I. Balint, Catal. Lett. 132 (2009) 81-86; C. Anastasescu, M. Anastasescu, V.S. Teodorescu, M. Gartner, M. Zaharescu, J. Non-Cryst. Solids 356 (2010) 2634-2640; C. Anastasescu, M. Anastasescu, M. Zaharescu, I. Balint, J. Nanopart. Res. 14 (2012) 1198]

Act. 1.2 Sinteza pulberilor de TiO2 prin metoda sol gel urmata de tratamentul hidrotermal pentru a obtine nanotuburi, conform cu rezultatele noastre publicate anterior (ICF)
Au fost obtinute nanotuburilor de titanat (TiTNT) prin metosa sol-gel combinata cu metoda hidrotermala, utilizand rute de sinteza verificate [C. Anastasescu, S. Preda, V. S. Teodorescu, M. Zaharescu, Proceedings of "Premier Colloque Francophone sur les Materiaux, les Procedes et l’Environnement", 31 Mai-6 Iunie, 2009 Busteni, Romania; S. Preda, V.S. Teodorescu, A.M. Musuc, C. Andronescu, M. Zaharescu, J. Mat. Res. 28 (2013) 294-303; S. Preda, M. Rutar, P. Umek, M. Zaharescu, Mat. Res. Bull. 71 (2015) 98-105].

Materialele pe baza de TiNT au un aspect tubular cu capetele deschise, un diametru interior de 10-12 nm, si o lungime de sute de nm cu structura cvasi-cristalina.

Act. 1.3 si Act. 1.4 Determinarea calitativa a activitatii hidrolitice a tulpinilor bacteriene halofilice / halotolerante (IBB); Selectia tulpinilor potrivite pentru producerea de enzime si imbunatatirea conditiilor de sinteza (IBB)
In cadrul etapelor 1.3 şi 1.4 au fost analizate tulpini bacteriene izolate din patru lacuri cu salinităţi diferite situate ȋn partea sud – estică a României, respectiv Lacul Movila Miresei, Lacul Amara (Buzău), Balta Albă şi Câineni.
Din cele patru lacuri au fost izolate 54 de tulpini incadrate ca bacterii moderat halofile sau halotolerante iar dintre acestea 7 tulpini au avut capacitatea de a hidroliza cazeina, 8 tulpini au degradat amidonul, 4 tulpini au prezentat activitate lipazică, 4 tulpini au hidrolizat Tween 80, 3 tulpini au folosit pectina ca substrat, 1 tulpină a hidrolizat xilanul și 1 tulpină a prezentat activitate celulazică.
 Evidenţierea capacităţii de hidroliză a amidonului

Act. 1.5 Optimizarea sintezei nanotuburilor de SiO2 si TiNT si tratament termic (ICF)
Au fost obtinute materiale optimizate de SiO2 si TiNT.
Optimizarea sintezei nanotuburilor de SiO2 a avut in vedere adaptarea morfologiei tubulare la cerintele aplicative ale prezentei teme de cercetare, urmarindu-se, suplimentar obtinerii ca morfologie majoritara a tuburilor de SiO2 goale la interior, o distributie uniforma a diametrului extern si intern, porozitate controlata si suprafata specifica semnificativa.
Parametrii si conditiile procesului de sinteza a probelor optimizate de SiO2 cu morfologie tubulara (SiO2_t) vor face obiectul unei cereri de patent.
Optimizarea nanotuburilor de TiO2 s-a realizat prin metoda hidrotermala asistata de microunde. Pentru ceasta, materialele de TiNT au fost sintetizate prin metoda hidrotermala asistata de microunde a precursorului de TiO2 anterior preparat prin metoda sol-gel sau comercial (Aldrich) sub forma de anatas, la o temperatura constanta si variind durata timpului de iradiere in camp de microunde. S-au obtinut atat nanotuburi pe baza de titanat (TiNT) cat si nanobare pe baza de titanat (TiNR).

Act. 1.6 Izolarea si purificarea partiala a enzimelor extracelulare din microorganisme halofilice / halotolerante (IBB)
In cadrul etapei 1.6 s-a urmărit purificarea parţială a unei enzime cu activitate lizin-decarboxilazică. În primă etapă, s-a încercat stimularea producerii lizin-decarboxilazei de către tulpina de bacterie halotolerantă selectată ȋn etapele anterioare. Au fost folosite trei variante de mediu de cultură pentru biosinteza enzimei.
Preparatul enzimatic parțial purificat a fost caracterizat biochimic, prin determinarea parametrilor fizico-chimici optimi de activitate catalitică, respectiv intervalul de pH şi valoarea pH optim de activitate, temperatura optimă de activitate, influenţa concentraţiei de clorură de sodiu asupra activităţii. Rezultatele au arătat o activitate catalitică optimă la valoarea de pH 7.5, o temperatură de 55 grade Celsius şi o concentraţie de NaCl cuprinsă ȋntre 0 şi 1M, fapt ce dovedeşte caracterul moderat halofil al proteinei cu activitate enzimatică purificată.

Act. 1.7 Caracterizarea nanotuburilor de SiO2 si TiNT: SEM, XRD, FT-IR, UV-UVIS, BET, PZC (ICF)
Caracterizarea morfologica a probelor cu morfologie tubulara (SiO2_NT si TiNT) a fost realizata prin microscopie electronica de baleaj (SEM), utilizând utilizând un microscop de inaltă rezolutie, FEI Quanta 3D FEG, care funcționează la 20 kV, sau un echipament FE-SEM, Jeol 7600F, operat la 1.5 keV combinata cu spectrometrie de raze X cu dispersie energetica (EDX) si prin microscopie electronica de transmisie (TEM), utilizand un echipament TEM, Jeol 2100, operat la 200 keV. Investigatiile privind cristalinitatea probelor obtinute s-a realizat prin difractie de raze X (XRD), utilizând un difractometru Rigaku Ultima IV, folosind radiatia Cu-Ka (1.5406 Å), si operand la 40 kV si 30 mA, identificarea fazelor cristaline fiind realizata cu programul PDXL (Rigaku) conectat la baza de date ICDD PDF-2.
Spectroscopia FT-IR a fost realizata utilizand Spectrometrul Nicolet Nico 6700 FT-IR in domeniul spectral cuprins intre 400 si 4000 cm-1. Spectrele probelor au fost colectate prin tehnica tabletarii cu KBr, sensibilitatea aparatului fiind de 4 cm-1.
Spectrele UV-VIS au fost obtinute utilizand un spectrofotometru Perkin Elmer Lambda 35 echipat cu sfera integratoare, in intervalul 200-1100 nm, cu o rezolutie spectrala de 2 nm. Energia benzii interzise a fost evaluata prin functia Kubelka-Munk.
Izotermele de adsorbtie a azotului s-au realizat la -196 oC, cu un aparat Micromeritics ASAP 2020 (probele fiind supuse unui tratament adecvat de degazare) iar suprafata specifica a fost evaluata cu ajutorul ecuatiei Brunauer-Emmett-Teller (BET). Curbele de distributie a dimensiunii porilor au fost obtinute prin metoda Barrett–Joyner–Halenda (BJH) pe ramura de desorbtie. Analiza termogravimetrica a fost efectuata cu un aparat Mettler-Toledo TGA/SDTA 851e. Masuratorile de potential zeta au fost efectuate cu un aparat Malvern Nano ZS Zetasizer, model ZEN 3600 la temperatura camerei.

Act. 1.8 Studii experimentale preliminare cu privire la imobilizarea enzimelor prin adsorbtie directa/aderenta pe matricea oxidica (IBB)
In cadrul etapei 1.8 au fost efectuate experimente preliminare cu privire la imobilizarea enzimelor prin adsorbtie directă/aderenţă pe matricea oxidica, reprezentată de cinci tipuri diferite de nanomateriale de dioxid de titan şi trei tipuri diferite de microtuburi de silice.
Rezultatele preliminare obţinute au evidenţiat că există o capacitate de imobilizare a enzimelor, ȋn particular cele cu activitate proteazică şi lipazică. Datele preliminare arată o capacitate de imobilizare mai buna pentru suporturile de titanat prin comparaţie cu cele de silice dar si faptul că pentru ambele tipuri de suporturi de imobilizare, activitatea enzimatică este mai ridicată ȋn cazul enzimei purificate prin gel filtrare comparativ cu enzimă parţial purificată. In primul caz, activitatea specifică este mai mare pe preparatul imobilizat pe nanostructurile de silice.

Act. 1.9 Modificarea superficiala a nanotuburilor de SiO2 cu grupari funcţionale pentru fixarea optima a enzimelor (ICF)
Optimizarea parametrilor de sinteza a nanotuburilor de silice a fost urmata de modificarea acestora prin:
(i) impregnare directa cu Au
(ii) funcţionalizare
(iii) modificare cu Au a probelor de SiO2 anterior funcţionalizate
Evidenţierea compusului hibrid „matrice oxidica-enzima” au fost obţinute din testele de imobilizare monitorizate prin (i) masuratori de spectrofotometrie si (ii) studii de spectroscopie IR si sunt in curs de pregatire pentru brevetare si apoi publicare.

Act. 1.10 Teste comparative/complete ale activitatii enzimatice folosind enzimele de interes (proteaza, lipaza, amilaza) imobilizate pe nanotuburi simple de TiNTsi nanotuburi functionalizate de SiO2, in stare nativa si pe mostre de sol (IBB)
In cadrul etapei 1.10 au fost prelevate probe de sol din zona localităţii Movila Miresei, judeţul Buzău şi din zona localităţii Şotrile – Barajul Paltinu din judeţul Prahova. Mostrele de sol au fost supuse unei analize preliminare care a constat ȋn evidenţierea compoziţiei chimice precum şi ȋncadrarea acestora ȋntr-o anumită categorie folosind determinatorul „Solurile României”.
 (a)   (b)
Aspectul zonei (Şotrile – Barajul Paltinu) de prelevare a mostrelor de sol: neantropizat – (a) şi uşor supus impactului antropic (b) - localizat lângă albia râului Doftana

Experimentele preliminare privind activităţile enzimatice de interes ȋn cadrul proiectului au evidenţiat prezenţa acestora ȋn probele de sol analizate, la valori relativ scăzute, fiind ȋnregistrate diferenţe ȋn funcţie de compoziţia chimică a solului dar şi de tipul de vegetaţie ȋntâlnit ȋn zonele din care au fost prelevate probele de sol. Aspecte ale acestei activităţi vor fi aprofundate şi ȋn etapa II (2018) a proiectului.

Raport de activitate cu rezultate si livrabile pentru anul 2018

Obiectivele proiectului pentru această etapă au fost indeplinite integral iar diseminarea rezultatelor obţinute s-a realizat prin elaborarea unei cereri de brevet de inventie cu titlul "Obtinerea prin procedeul sol-gel a tuburilor de SiO2 cu diametru nanometric, modificarea acestora cu grupari functionale si metale in vederea imobilizarii de enzime" (Nr. OSIM A/00094 din 18.04.2018) si a unui articol ştiinţific (contributie invitata) publicat in revista Molecules intr-un numar dedicat materialelor sol-gel functionalizate "Special Issue Sol-Gel Chemistry. From Molecule to Functional Materials."" (doi:10.3390/molecules23061362). De asemenea, diseminarea rezultatelor obţinute se va continua si dupa inchiderea proiectului (30 iunie 2018) prin elaborarea unui articol ştiinţific de specialite ce urmeaza sa fie trimis la o revista ISI precum si prin participarea la doua conferinte cu 1 prezentare orala şi 3 postere (Craiova si Chisinau). Rezultatele obţinute corespund cu rezultatele aşteptate după cum este menţionat in Planul de realizare a proiectului.

Act 2.1 (IBB): Teste comparative/complete ale activitatii enzimatice folosind enzimele de interes (proteaza, lipaza, amilaza) imobilizate pe nanotuburi simple de TiNTsi nanotuburi functionalizate de SiO2, in stare nativa si pe mostre de sol – Partea II

În cadrul etapei 2 a proiectului s-a urmărit, într-o primă etapă, purificarea parţială şi caracterizarea biochimică a enzimelor extracelulare de interes (proteaze, amilaze, lipaze), urmată de imobilizarea enzimelor pe suport anorganic, folosind metoda adsorbţiei directe. Ulterior, a fost testată capacitatea sistemului hibrid de a contribui la viteza de accelerare a biodegradării, prin evaluarea activitătilor ureazei, dehidrogenazei si a fosfatazei alcaline, folosind solul ca model experimental.

Pe baza rezultatelor obtinute în etapa anterioară s-au selectat, pentru realizarea acestui studiu, 2 tulpini de bacterii halotolerante, înalt producătoare de amilaze si proteaze, IBB₃₇ si IBB₂₄. Tulpinile bacteriene au fost izolate dintr-o probă de nămol din lacul Movila Miresei, judetul Brăila si s-au remarcat prin capacitatea de a prezenta activităti hidrolitice multiple. De asemenea, tulpina de bacterie moderat halofilă, Marinococcus halophilus JCM2472, a fost introdusă în efectuarea experimentelor, datorită capacitătii acesteia de a sintetiza lipaze/esteraze.

Imobilizarea enzimelor s-a realizat pe suport anorganic, reprezentat de nanomateriale cu morfologie tubulara de dioxid de titan (TiO₂) si silice (SiO₂).

Solul folosit pentru efectuarea testelor experimentale a fost prelevat din zona Paltinu, judetul Prahova, de la o adâncime de 5-10 cm, având coordonatele GPS: 45°13'35'' N /25°43'53''E. pH-ul solului prelevat are valoarea 8.

Aspectul zonei de prelevare a mostrelor de sol de la Movila Miresei

1.Purificarea partială a preparatelor enzimatice extracelulare

1.1 Purificarea enzimelor proteolitice extracelulare

Pentru realizarea acestui studiu, a fost selectată o tulpină de bacterie halotolerantă, IBB₃₇, bună producătoare de enzime proteolitice. Selectia s-a bazat pe datele obtinute în cadrul etapei anterioare, prin care a fost testată capacitatea tulpinilor bacteriene de a sintetiza enzime hidrolitice extracelulare. Biosinteza enzimelor proteolitice s-a efectuat în mediu lichid MH suplimentat cu 1% cazeină. Mediul a fost însământat cu inocul bacterian lichid aflată în faza exponentială de crestere, în raport de 9:1.

Activitatea proteazică s-a determinat prin metoda Anson modificată pentru cazeină, dozând produsii de hidroliză eliberati din cazeină sub actiunea enzimei cu reactivul de culoare Folin-Ciocâlteu. Activitatea enzimatică s-a exprimat în unităti/mg proteină (U/mg).

A fost continuată etapa de purificare a extractului proteic prin folosirea metodei de cromatografie prin gel filtrare. S-a determinat în fiecare fractie concentratia proteică prin metoda Lowry si activitatea proteolitică.

Au fost investigate (Fig. 1): (i) influenţa pH-ului asupra activităţii proteazice; (ii) influenţa concentraţiei de substrat asupra activităţii enzimatice; (iii) influenţa temperaturii asupra activităţii catalitice si (iv) influenţa concentraţiei de NaCl asupra activităţii catalitice

(a) (b)

(c) (d)

Fig.1. Influenta pH-ului (a), a concentratiei substratului (b), temperaturii (c) si concentratiei NaCl (d), asupra activitatii enzimatice.

1.2 Purificarea enzimelor lipolitice extracelulare

Tulpina de bacterie moderat halofilă, Marinococcus halophilus JCM 2472 (Riken), a fost selectată pentru realizarea testelor experimentale datorită capacitătii acesteia de a sintetiza lipaze/esteraze. Metodele de purificare ale proteazei extracelulare au fost folosite si în cazul lipazelor cu localizare extracelulară. Pentru determinarea activitătii lipolitice a fost utilizat ca substrat p-nitrofenilbutiratul. p-nitrofenolul (pNP) eliberat sub actiunea enzimei a fost observată spectrofotometric, la 410 nm fată de un martor care a fost reprezentat de solutia de enzimă. O unitate de activitate a fost definită ca acea cantitate de enzimă care eliberează în conditiile date 1µmol pNP într-un minut. Concentratia proteică s-a determinat prin metoda Lowry si s-a exprimat ca mg proteină/mL lichid.

1.3 Purificarea enzimelor amilazice extracelulare

Pentru biosinteza enzimelor amilazice extracelulare a fost selectată tulpina IBB₂₄, înalt producătoare de amilaze extracelulare. Exoenzima a fost obtinută prin cultivarea tulpinii bacteriene pe mediu MH lichid, suplimentat cu 1% amidon. Pentru purificarea amilazelor s-au utilizat o serie de etape incluzând precipitarea fractionată cu acetonă si gel filtrare. Determinarea activitătii amilazice s-a realizat prin metoda Hostettler. În paralel, s-a realizat si o probă martor tratată identic cu proba de analizat, dar în care solutia enzimatică a fost adăugată după introducerea reactivului dinitrosalicilic. Activitatea amilazică s-a exprimat în µmoli/min/mL. O unitate de activitate amilazică a fost definită ca acea cantitate de enzimă care eliberează 1µmol maltoză pe minut. Concentratia proteică s-a determinat prin metoda Lowry si s-a exprimat ca mg proteină/mL lichid.

2. Capacitatea de imobilizare a enzimelor de interes pe suport anorganic

În cadrul experimentelor din această etapă a fost determinată capacitatea de imobilizare a exoenzimelor de interes pe suport anorganic, reprezentat de materiale de dioxid de titan si dioxid de silice. Au fost luate în lucru 10 probe de materiale, astfel: P1- proba de nanotuburi de titanat (NaTNT/135°C/72h AIE), P2- proba de nanotuburi de titanat (NaTNT 135°C/72h BIE), P3- proba de nanotuburi de titanat dopat cu Cu (Cu-TiNT), P4- proba de nanobare de titanat (NaTNR 175°C/72h HT), P5- proba de nanobare de titanat (NaTINR/H/175°C, 72h), P6- proba de nanotuburi de silice (SiO₂-t), P7- proba de nanotuburi de silice functionalizata chimic (SiO₂tF), P8- proba de nanotuburi mari de silice (SiO₂-T), P9- proba de nanotuburi de silice modificata cu Au direct (AuSiO₂t), P10- proba de nanotuburi de silice functionalizata chimic si modificata cu Au (AuSiO₂tF). Etapa de imobilizare s-a efectuat prin metoda de adsorbtie, prin punerea în contact a 0,05g material cu 5 mL extract enzimatic partial purificat.Pentru stabilirea capacitătii de imobilizare s-a dozat proteina prin metoda Lowry în solutiile influent (solutia enzimatică initială), efluent (solutia decantată după cuplare) si tamponul de spălare. A fost calculată apoi diferenta dintre cantitatea initială de enzimă si cea în exces, iar prin raportarea cantitătii de enzimă fixată la 1g de suport s-a determinat capacitatea de imobilizare (mg enzimă/gram suport).

Act 2.2 (ICF+IBB): Validarea sintezei optimizate si a activitatii enzimatice a materialelor hibride constând în sistem hibrid reproductibil cu rezultate constante ale testelor activitătii enzimatice, utilizând enzimele native, cât si soluri test

3. Testarea functionalitătii sistemului hibrid format

Testarea functionaliztatii sistemului hibrid s-a efectuat in doua moduri. (A) Un prim mod a fost realizat prin testarea sistemului Silice-lipaza, la scala de laborator, intr-o reactie enzimatica, anume hidroliza p-nitrofenil acetat (p-NPA). (B) Pentru cel de-al doilea mod de testare a functionaliztatii, sistemul hibrid format prin imobilizarea enzimelor de interes pe diferite suporturi anorganice de dioxid de titan si silice a fost testat prin cuplarea acestuia în raport de 1:1 cu sol antropizat, folosit ca model experimental.

(A) Activitatea stiintifica din cadrul etapei a 2-a a proiectului (2018) a continuat studiile de optimizare a sintezei nanotuburilor de SiO₂, adaugand pentru comparatie si morfologia sferica. De asemenea s-au extins studiile preliminare de imobilizare a lipazei efectuate in etapa I (2017) care au utilizat lipaza porcina utilizandu-se anul acesta si lipaza din Rhizopus orizae, in vederea obtinerii unui grad de adsorbtie mai ridicat datorita interactiei electrosctatice dintre suprafata silicei incarcate negativ si lipaza incarcata pozitiv la pH-ul de lucru 6. Scopul final al acestei imobilizari a fost evaluarea activitatii enzimatice a hibridului si influenta morfologiei matricei de SiO₂ asupra aceteia.

Astfel, prezentul studiu a analizat comportamentele diferite ale silicei cu morfologii diferite (două tipuri de nanotuburi, cu diametru mare si mic, precum si particule sferice) fată de adsorptia lipazei si a activitatii sale catalitice dupa imobilizare in reactia de hidroliza a p-NPA. Au fost urmarite urmatoarele obiective: (a) determinarea parametrilor optimi ai sintezei SiO₂ prin metoda sol-gel asistată de un template generat în situ, în corelatie cu conditiile necesare pentru a maximiza gradul de adsorbtie a lipazei pe suprafata silicei cu morfologie sferica si tubulara, si pentru a sublinia influenta diametrului intern al nanotuburilor asupra gradului de imobilizare si a activitatii catalitice a lipazei din Rhizopus orizae. În consecintă, s-au efectuat analize de microscopie electronică de baleiaj (SEM), porozimetrie si suprafata specifica (absorbtie de N₂) si spectroscopie în infrarosu cu transformata Fourier (FT-IR). (b) Demonstra formarii structurii hibride SiO₂-lipaza. În acest scop, caracterizarea materialului hibrid a fost realizată prin FT-IR-ATR, spectrofluorescenta, potential electrocinetic (potential Zeta) si măsurători de carbon organic total (TOC). (c) Testarea activitatii materialului hibrid (lipază-SiO₂) pentru reactia de hidroliză a p-nitrofenil acetat-ului (p-NPA), efectuate în prezenta lipazei imobilizate pe SiO₂ cu diferite morfologii.

Au fost preparate matrici oxidice de SiO₂ cu morfologie tubulara diferita (Fig. 2), anume: (a) nanotuburi cu diametru mic (<100 nm) denumite SiO₂-t si tuburi cu diametru mai mare (> 200 nm - denumite SiO₂-T) prin metoda sol-gel. Pentru a cerceta influenta morfologiei asupra activitătii catalitice a structurilor hibride derivate, s-a preparat prin metoda sol-gel un al treilea material continând numai particule sferice (denumit SiO₂-S).

SiO2-t	SiO2-T	SiO2-T

Fig.2. Micrografii SEM ale matricilor oxidice de silice

Investigatiile de sprectrofluorescenta au aratat ca atunci când excitatia probei este efectuată la λ_exc = 320 nm, fluorescenta intrinsecă a matricei SiO₂-t poate fi luată în considerare, asa cum se arată în Fig. 3, unde fluorescenta enzimelor apare ca un umăr putin pronuntat, situat la ~ 360 nm.

Fig. 3 Spectrul de fluorescentă înregistrat pentru lipaza legată de SiO₂-t pentru λ_exc = 320 nm. (utilizand echipamentul Carry Eclipse achizitionat in cadrul proiectului)

Fig. 4 ilustrează capacitatea de încărcare cu lipaza a fiecărei probe de SiO₂. În mod interesant, cea mai mare capacitate de încărcare este observată pentru tuburile mari (SiO₂-T) si cea mai mică pentru morfologia sferică (SiO₂-S).

Fig.4. Capacitatea de incarcare cu lipaza pe matricile de SiO₂.

Potentialul electro-cinetic (ξ) a fost determinat pentru a descifra si a evalua interactiunile electrostatice dintre suprafata silicei si enzimă, acesta fiind un parametru cheie pentru un grad ridicat de adsorbtie a lipazei pe suprafata silicei, aceste măsurători fiind efectuate pentru: (i) pulberile de SiO₂ dispersate în apă, (ii) lipaza imobilizată pe pulberi de SiO₂ re-dispersate în apă si (iii) pulberile de SiO₂ dispersate într-o solutie de lipază si fosfat de potasiu la 25 ° C. Fig. 5 ilustrează clar încărcarea negativă a tuturor celor trei probe de SiO₂ în mediu apos, cea mai mare valoare negativă a potentialului electrocinetic fiind înregistrată pentru silice sferică (SiO₂-S).

Fig.5. Potentialul electrocinetic al matricilor de SiO₂si al sistemelor hibride derivate din acestea.

Reactia de hidroliza p-nitrofenil acetat-ului (p-NPA) a fost utilizată pentru a investiga cinetica enzimatică. Fig. 6 ilustrează capacitatea de hidroliză mai mare a complexelor hibride pe bază de silice cu o morfologie tubulară (t si T) comparativ cu cele sferice (S), în ceea ce priveste concentratia p-NP exprimata in µM, care este în concordantă cu rezultatele TOC.

Fig.6 Concentratia p-NP (µM) rezultată din reactia de hidroliză a p-NPA efectuată în prezenta lipazei imobilizate pe probe de SiO₂.

Rezultatele prezentate mai sus privind sinteza, caracterizarea si functionalizarea enzimatică a matricelor de silice tubulare si sferice sunt în concordantă cu cele mai recente încercări de a proiecta purtători hibrizi anorganici-enzimă accesibili si eficienti.

(B) Pentru cel de-al doilea mod de testare a functionaliztatii, sistemul hibrid format prin imobilizarea enzimelor de interes pe diferite suporturi anorganice de dioxid de titan si silice a fost testat prin cuplarea acestuia în raport de 1:1 cu sol antropizat, folosit ca model experimental. Aprecierea ratei de biogedradare s-a realizat prin urmărirea activitătilor fosfatazei alcaline, a ureazei si a dehidrogenazei din proba de sol cuplată cu extractul enzimatic imobilizat pe suportul anorganic, precum si din solul tratat doar cu materiale, după 72h de la cuplare. De asemenea, s-au determinat activitătile enzimatice si din proba de sol antropizată netratată.

Determinarea activitătii fosfatazei alcaline

Dozarea activitătii fosfatazei alcaline utilizând ca substrat p-nitrofenil fosfat, din solul tratat si netratat, s-a efectuat prin metoda Tabatabai. Cantitatea de p-nitrofenol eliberat per unitatea de timp, determinat în mediul alcalin la 400 nm, reprezintă o măsură a activitătii fosfatazei. Mixul de reactie a fost filtrat si s-a determinat concentratia de p-nitrofenol din proba analizată pe baza valorilor absorbantei la 400 nm. Activitatea enzimatică s-a exprimat ca µmoli/h/mL.

Determinarea activitătii ureazei

Activitatea ureazică a fost determinată prin metoda cu reactivul Nessler si s-a bazat pe dozarea colorimetrică a amoniacului format în urma actiunii enzimei asupra ureei. În mediu alcalin, reactivul Nessler formează cu amoniacul un complex de culoare galben-portocalie, intensitatea culorii fiind direct proportională cu activitatea enzimatică.

În paralel, s-a realizat si o probă martor care a fost tratată în aceleasi conditii, dar la care reactia enzimatică a fost stopată înainte de a adăuga sursa de enzimă. Activitatea ureazică s-a exprimat în µmoli NH₃ / mL·min. Unitatea de activitate ureazică s-a definit ca fiind acea cantitate de enzimă care formează 1µmol amoniac în decurs de 1 minut la 37°C.

Determinarea activitătii dehidrogenazei

Dehidrogenaza joacă un rol important în etapele initiale ale oxidării materiei organice din sol prin transferul reversibil de hidrogen şi electroni de la substrate organice spre acceptori (Ross, 1971). Procesul de măsurare a activităţii dehidrogenazice a implicat incubarea probei, în prezenţa clorurii de trifenil tetrazolium, cu un substrat donor de electroni. În forma oxidată, clorura de trifenil tetrazolium este incoloră însă, în prezenţa dehidrogenazelor, aceasta este redusă la trifenil formazan de culoare roşie. Activitatea dehidrogenazică din sol a fost determinată prin folosirea metodei Casida (1977). Densitatea optică a filtratului a fost măsurată la 490 nm faţă de etanol. Concentraţia de formazan s-a determinat pe baza unei curbe etalon de clorură de trifenil formazan. Activitatea enzimatică s-a exprimat ca µg formazan/g sol.

Rezultatele obtinute demonstrează o activitate a fosfatazei alcaline mai pronuntată în probele de sol cuplate cu sistemul hibrid format pe baza imobilizării proteazelor pe suportul anorganic, în comparatie cu probele de sol cuplate cu amilazele si lipazele imobilizate pe substratul oxidic. Aceeasi manifestare a activitătii fosfatazei alcaline a fost observată si fată de proba de sol antropizat, dar si fată de solul tratat cu materialele cu structură anorganică. Rezultatele au fost comparabile pentru ambele matrici anorganice testate, cea mai mare valoare fiind obtinută în cazul variantei P2, care are ca substrat anorganic dioxidul de titan. În cazul sistemului hibrid format pe baza imobilizării lipazelor pe matricea anorganică, maximul de activitate a fosfatazei alcaline s-a înregistrat în varianta experimentală notată P1, ce are ca suport titanatul de sodiu. Cea mai mare valoare a fosfatazei alcaline pentru solul tratat cu enzimele amilolitice imobilizate pe suportul oxidic, a fost obtinută  în varianta P7, ce are ca matrice dioxidul de siliciu.

Activitatea ureazică a sistemului hibrid bazat pe imobilizarea enzimelor de interes pe suport anorganic s-a remarcat prin valori superioare probei de sol antropizate. În cazul variantei P7 a probei de sol cuplată cu amilaze imobilizate, ureaza a prezentat cea mai mare valoare de activitate. Maximul de activitate ureazică pentru sistemul hibrid format din cuplarea solului cu proteazele imobilizate a fost obtinut pentru variantele P8 si P9. Matricea oxidică, folosită atât în cazul amilazelor cât si în cazul proteazelor imobilizate care au prezentat maxim de activitate, a fost reprezentată de dioxidul de siliciu. În varianta experimentală ce a avut la bază lipazele imobilizate, valorile pentru activitatea ureazică au fost comparabile.

Dehidrogenaza a înregistrat activitate în toate variantele testate. În comparatie cu valoarea de activitate din proba de sol antropizată, s-a observat o crestere semnificativă a valorilor de activitate în variantele de sol-P1, sol-P2, sol-P3, sol-P5, sol-P6, sol-P8, sol-P10, tratate doar cu materialele. Valorile activitătii dehidrogenazice din probele de sol tratate doar cu materiale sunt superioare probelor de sol cuplate cu enzimele imobilizate pe suportul anorganic, cu exceptia variantelor sol-P4, sol-P7, sol-P9.